24.05.2018
PL EN
09.02.2018 aktualizacja 09.02.2018

IChF PAN podgląda reakcje chemiczne w superrozdzielczości

Obserwowanie reakcji zachodzących wewnątrz żywych komórek, a nawet w ich organellach, takich jak jądra komórkowe - umożliwia nowa metoda śledzenia reakcji chemicznych za pomocą jednej z superrozdzielczych technik mikroskopowych, opracowana w IChF PAN.

O nowej metodzie analizy poinformował Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) w przesłanym PAP komunikacie.

Dopiero od niedawna mamy do dyspozycji narzędzia pozwalające bezpośrednio przyglądać się zjawiskom chemicznym zachodzącym w żywych komórkach. Z powodu ograniczeń technicznych wciąż nie mamy jednak tak podstawowej wiedzy, jak ta o wartościach stałych równowagi reakcji chemicznych w komórkach - czyli o tym, jaka część substancji chemicznych zaangażowanych w daną reakcję występuje w komórce w formie przereagowanej, a jaka w nieprzereagowanej.

Przeciwności te udało się pokonać naukowcom z IChF PAN. We współpracy z berlińską firmą PicoQuant GmbH opracowali oni i zademonstrowali modyfikację jednej z najnowocześniejszych technik mikroskopowych: superrozdzielczej spektroskopii korelacji fluorescencji.

Jak podkreślono w komunikacie, do zastosowania nowej metody analitycznej nie są potrzebne zmiany w aparaturze. Po odpowiedniej adaptacji metoda może być użyta w celu dokładniejszego interpretowania danych zarejestrowanych przez już wyprodukowane mikroskopy korzystające z techniki STED.

"Reakcje biologiczne są na ogół odwracalne i tam, gdzie zachodzą, zwykle wytwarza się pewna dynamiczna równowaga między ilością substancji przereagowanych a związkami nieprzereagowanymi - tłumaczy cytowany w informacji prasowej prof. dr hab. Robert Hołyst z IChF PAN. - Próbując wyznaczyć stałe równowagi dla różnych reakcji w komórkach sięgnęliśmy po superrozdzielczą spektroskopię korelacji fluorescencji. I tu natknęliśmy się na ciekawy problem techniczny, którego rozwiązanie otworzyło nam nowe możliwości w badaniu chemii życia."

Istnieje wiele odmian mikroskopii, część spośród których umożliwia nawet dostrzeżenie pojedynczych atomów. Jak jednak podkreśla IChF PAN, przy obserwowaniu komórek bezkonkurencyjna pozostaje mikroskopia optyczna, z uwagi na małą inwazyjność i możliwość obrazowania struktury przestrzennej żywych organizmów. Jej podstawową wadą przez długi czas była jednak słaba rozdzielczość: fundamentalne ograniczenia fizyczne (dyfrakcyjne) powodują, że standardowymi technikami optycznymi nie można rozróżnić szczegółów mniejszych od ok. 200 nanometrów.

Jedną z odmian mikroskopii optycznej jest mikroskopia fluorescencyjna. Polega ona na wprowadzeniu barwnika fluorescencyjnego w badane miejsca próbki biologicznej, a następnie skanowaniu próbki zogniskowaną wiązką lasera. W ten sposób cząsteczki barwnika znajdujące się w ognisku zostają pobudzone do świecenia. Przepuszczając wyemitowane przez nie światło przez specjalny otwór (konfokalny) można otrzymać obrazy o podwyższonej rozdzielczości.

Jak przypomniano w komunikacie, w 1994 roku Stefan W. Hell zaprezentował sposób przekroczenia limitu dyfrakcyjnego w mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą wygaszania emisją wymuszoną (STimulated Emission Depletion, STED). STED wymaga dodatkowej wiązki laserowej, przypominającej w przekroju pączek z dziurką. Odpowiednio użyta, wiązka ta wygasza zewnętrzne obszary ogniska głównej wiązki laserowej i w konsekwencji redukuje jego rozmiary do wartości mniejszych od limitu dyfrakcyjnego. Metodami superrozdzielczymi można dziś dostrzec detale przestrzenne o rozmiarach zaledwie 10 nm przy rozdzielczości czasowej sięgającej mikrosekund.

Stosunkowo młodą gałęzią mikroskopii optycznej jest z kolei mikroskopia konfokalna z korelacją fluorescencji (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS). W odmianach superrozdzielczych ognisko lasera ma tu objętość liczoną w dziesiątkach attolitrów (jeden attolitr to miliardowa część jednej miliardowej litra). Pomiar polega na mierzeniu światła emitowanego przez barwnik fluorescencyjny doczepiony do badanej cząsteczki, wzbudzony przez wiązkę laserową. Znając rozmiary ogniska i czas trwania fluorescencji oraz wspomagając się odpowiednimi modelami teoretycznymi, można tu dość precyzyjnie ustalić prędkość ruchu nawet pojedynczych cząsteczek.

"Od pewnego czasu było wiadomo, że o ile superrozdzielcza mikroskopia FCS sprawdza się przy obserwowaniu cząsteczek poruszających się w dwóch wymiarach, np. w membranach lipidowych, o tyle zawodzi przy obserwacjach w pewnej objętości - mówi dr Krzysztof Sozański z IChF PAN, cytowany w komunikacie. - Czasy dyfuzji, wyznaczane na podstawie pomiarów w 3D, potrafiły się różnić od przewidywań z pomiarów w 2D o rząd wielkości, a nawet więcej. Po kilku miesiącach badań stało się dla nas jasne, że za te rozbieżności odpowiada zbyt uproszczony sposób wyznaczania przestrzennych rozmiarów ogniska".

Warszawskim naukowcom udało się skonstruować nowy, uniwersalny model teoretyczny, wprowadzający korektę przestrzennego kształtu ogniska i uwzględniający jej wpływ na zmierzony stosunek sygnału do szumu. Poprawność modelu początkowo zweryfikowano w pomiarach szybkości dyfuzji różnych fluoryzujących próbników w roztworach.

"Wykonaliśmy też bardziej zaawansowane eksperymenty - wyjaśnia w komunikacie doktorant IChF PAN Xuzhu Zhang. - Badaliśmy na przykład odwracalną reakcję, w której cząsteczki barwnika przyczepiały się do micel, a po pewnym czasie się odczepiały. Układ zbudowany ze stosunkowo dużych kulek z cząsteczek surfaktantów reagujących z cząsteczkami barwnika odwzorowywał warunki charakterystyczne dla obiektów biologicznych".

Przeprowadzenie tych pomiarów nie było rzeczą łatwą. Gdyby cząsteczki obu reagentów poruszały się wolno, podczas przechodzenia przez ognisko barwnik mógłby wielokrotnie się łączyć/odłączać z/od micel i emitowane światło byłoby uśrednione. Ale mógł też zajść wariant skrajnie inny: reakcje przyłączania i odłączania przebiegające tak wolno, że w trakcie przejścia przez ognisko nie dochodziłoby do zmian relacji między reagentami – wtedy uśredniania by nie było.

"Nasz model uwzględnia nie tylko oba przypadki skrajne, ale także wszystkie pośrednie. A dysponując wiedzą o rzeczywistych rozmiarach ogniska jesteśmy w stanie zmieniać jego wielkość i w tym samym układzie chemicznym i na tym samym sprzęcie przebadać eksperymentalnie wszystkie przypadki wymagane przez model" - podkreśla Zhang.

PAP - Nauka w Polsce

kflo/ agt/

Copyright © Fundacja PAP 2018